高岡智則
年齢：33歳 性別：男性 職業：Webディレクター（兼ライティング・SNS運用担当） 居住地：東京都杉並区・永福町の1LDKマンション 出身地：神奈川県川崎市 身長：176cm 体系：細身〜普通（最近ちょっとお腹が気になる） 血液型：A型 誕生日：1992年11月20日 最終学歴：明治大学・情報コミュニケーション学部卒 通勤：京王井の頭線で渋谷まで（通勤20分） 家族構成：一人暮らし、実家には両親と2歳下の妹 恋愛事情：独身。彼女は2年いない（本人は「忙しいだけ」と言い張る）
はじめに
このページでは逆転移pcr（RT pcr とも呼ばれることがあります）について、初心者にも分かる言葉で丁寧に解説します。逆転写pcrはRNAという遺伝情報を一度DNAに変換してから増やす技術です。病院の検査や研究室の実験で使われる基本的な手法のひとつです。
逆転写pcrとは
逆転写pcrは通常のPCRとは少し違います。通常のPCRはDNAを増やしますがRNAを直接扱うことはできません。そこで 逆転写酵素 という特別な酵素を使い、RNAをDNAの一種であるcDNAに転写します。次に DNAポリメラーゼ がこのcDNAの一部をテンプレートとして認識し、特定の領域を何度も複製します。こうしてRNAの情報をDNAとして取り出し増やすことができます。
仕組みと流れ
逆転写pcr は2段階の反応で成り立っています。最初の段階は 逆転写 の段階でRNAをcDNAに変換します。二番目の段階は PCR増幅 の段階で、選んだプライマーと呼ばれる短いDNA断片を使って目的の遺伝子領域を何度も増やします。
手順のイメージ
1. RNAの抽出 研究対象から高純度のRNAを取り出します。RNAは安定性が低いので厳密な取り扱いが必要です。
2. 逆転写 取り出したRNAに 逆転写酵素 を加え、cDNAを作ります。これによりRNAの情報がDNAの形になりました。
3. PCR増幅 作成したcDNAをテンプレートとして DNAポリメラーゼ が働き、特定の領域を何度も増やします。ここで使うプライマーは目的の遺伝子を選ぶ鍵になります。
4. 検出 増えたDNAを検出します。長い間はゲル電気泳動で見る方法やリアルタイムで量を測る方法があります。
用途と違い
逆転写pcr はRNAウイルスの検出や遺伝子発現の測定に使われます。現代の医療では新型コロナウイルスの検査などにも応用されました。言い換えるとRNAの情報をDNAとして取り出し増やすことで、検査や解析がしやすくなるのです。
反応の成分と役割の表
| 項目 | 役割 |
|---|---|
| RNA抽出 | 試料からRNAを純粋に取り出す作業 |
| 逆転写酵素 | RNAをcDNAへ写し取る酵素 |
| DNAポリメラーゼ | cDNAを増やすための酵素 |
| プライマー | 増やす領域を決める短いDNA断片 |
| dNTP | 新しいDNAを作る材料 |
| Mg2+とバッファ | 酵素の動作環境を整える |
注意点とコツ
RNAはとても不安定なので、RNaseの混入を避けるために清潔な器具と適切な保存条件が必要です。また陽性・陰性のコントロールを用意し、無逆転写対照などを入れて実験の信頼性を確認します。
まとめ
逆転写pcrはRNAを扱うときの基本技術であり、RNAをDNAに変換してから増やすという2段階の仕組みが特徴です。正しく行えば感染症の検査や遺伝子の発現量の測定など、さまざまな科学的問いに答える強力な道具になります。初心者の方は手順の基本を押さえつつ、適切なコントロールと安全管理を最初に学ぶことが大切です。
逆転写pcrの同意語
- RT-PCR
- Reverse transcription PCR の略。RNAをまず逆転写してDNAに変換し、そのDNAをPCRで増幅する手法。
- 逆転写PCR
- RNAをDNAに変換する逆転写反応の後にPCRで増幅する、逆転写を使うPCR法。
- 逆転写pcr
- RT-PCRの別表記。大文字・小文字の違いのみ。
- RT‑PCR
- RT-PCR の別表記。英語表記。
- リアルタイムRT-PCR
- 増幅の過程をリアルタイムで検出して定量するタイプのRT-PCR。
- RT-qPCR
- Reverse transcription followed by quantitative PCR の略。リアルタイム検出で定量するRT-PCRのこと。
- 定量RT-PCR
- PCRで増幅したDNAの量を定量する目的で使われるRT-PCRの表現。
- 定量的RT-PCR
- 定量を目的としたRT-PCRの表現。
- リアルタイム定量RT-PCR
- リアルタイム検出と定量機能を組み合わせたRT-PCRの総称。
- RT-qPCR法
- RT-qPCR の表現。方法を指す語（法）として使われることがある。
- 逆転写PCR法
- 逆転写PCRを実施する方法・手段を指す表現。
- cDNA合成後のPCR
- RNAをまずcDNAに変換してからPCRを行う2段階のプロセスを指す説明的表現。
- RT-PCRアッセイ
- RT-PCR を用いた検査・測定を指す表現。
逆転写pcrの対義語・反対語
- 通常のPCR
- DNAテンプレートを直接増幅する標準的なPCR。RNAを逆転写してからDNAへ変換する過程（逆転写）を含まない。
- 標準PCR
- 通常のPCRと同義で、DNAテンプレートを用いて直接増幅する手法。RTステップは不要。
- DNAテンプレートPCR
- DNAをテンプレートとして用い、逆転写を必要としないPCR。RT-PCRの対義語的な意味合い。
- 逆転写を伴わないPCR
- 逆転写酵素を用いず、DNAテンプレートだけを対象に増幅するPCRの意味合い。
- RTなしPCR
- Reverse Transcriptaseを使わないPCR。RNAを扱わず、DNAを直接増幅するタイプのPCR。
- DNAベースPCR
- DNAを基盤としたPCRの意味。RNAを逆転写して扱うRT-PCRとは異なるタイプ。
逆転写pcrの共起語
- RNA
- リボ核酸。RT-PCRの元データとなる分子です。
- DNA
- デオキシリボ核酸。PCRで増幅される分子です。
- cDNA
- 補完DNA。逆転写酵素でRNAから作られるDNAのことです。
- 逆転写酵素
- RNAをDNAに変換する酵素の総称。代表例に逆転写酵素がある。
- PCR
- ポリメラーゼ連鎖反応。DNAを特定の部位から増幅する技術です。
- テンプレートRNA
- 反応の鋳型となるRNAのことです。
- プライマー
- 目的のDNA領域を認識し結合する短いDNA片です。
- プライマー設計
- どの部位を増幅するか決める設計作業のことです。
- dNTP
- デオキシヌクレオシド三リン酸。DNAを作る材料です。
- Mg2+
- 反応に必要な補因子で酵素活性を調整します。
- 反応混合液
- PCR反応に必要な全成分を含む液体です。
- Taqポリメラーゼ
- DNAを伸長させる酵素の一つでPCRの核となります。
- 蛍光染料
- リアルタイムPCRでDNA量を検出するための色素です。
- SYBR Green
- 蛍光染料の一つで全体の増幅を検出します。
- TaqMan
- 特異的なプローブを使う定量PCR法の一つです。
- リアルタイムPCR
- 増幅をリアルタイムで測定して量を推定する方法です。
- 定量PCR
- DNAの量を定量的に測定するPCRの総称です。
- Ct値
- 閾値を越えたサイクル数を表す指標です。発現量の比較に使います。
- ノーRTコントロール
- 逆転写を行わないコントロール。DNA汚染の有無を確認します。
- ネガティブコントロール
- 陰性の結果を確認する対照で反応の汚染をチェックします。
- ポジティブコントロール
- 陽性の結果を確認する対照で反応が正常に動くかを確認します。
- 1-step RT-PCR
- 逆転写とPCRを同一反応管で行う方法です。
- 2-step RT-PCR
- 逆転写を別の反応で行い、後でPCRを実施します。
- アニーリング温度
- プライマーが最も結合しやすい温度のことです。
- アニーリング時間
- プライマーが結合する時間のことです。
- 熱サイクル
- 温度を何度も変えて反応を進める過程の総称です。
- 温度条件
- 反応中の温度設定のことです。
- RNA抽出
- 試料からRNAを取り出す前処理のことです。
- RNA純度
- 抽出したRNAの純度の度合いを指します。
- DNA汚染
- 反応系にDNAが混入している状態のことです。
- DNase処理
- DNAを分解して汚染を減らす処理のことです。
- 標準曲線
- 定量PCRで量を推定するための基準となる曲線です。
- 増幅曲線
- リアルタイムPCRで増幅の様子をグラフ化した曲線です。
- PCR阻害因子
- 反応を妨げる物質のことです。
- 蛍光信号
- PCR中の蛍光の出方を指します。量の指標になります。
- 検出感度
- 検出できる最小の量のことです。
逆転写pcrの関連用語
- 逆転写PCR
- RNAを鋳型にしてcDNAを合成し、それをPCRで増幅する技術。発現解析やウイルスRNA検出に用いられる。
- 逆転写酵素
- RNAをDNAへ転写する酵素。代表例としてM-MLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素など。
- RNAテンプレート
- 逆転写の鋳型となるリボ核酸。細胞内のmRNAやウイルスRNAなど。
- cDNA
- 逆転写酵素で作られたDNAのコピー。PCRの鋳型として用いられる。
- プライマー
- PCRで特定のDNA領域を増幅する短い核酸鎖。オリゴdT、ランダムヘキサマー、遺伝子特異的プライマーなどがある。
- オリゴdTプライマー
- ポリA尾部を持つmRNAの3'末端に結合して逆転写を開始するプライマー。
- ランダムヘキサマー
- RNA全体にランダムに結合して逆転写を行う際に用いるプライマー。
- 遺伝子特異的プライマー
- 特定の遺伝子配列にのみ結合するプライマー。
- one-step RT-PCR
- 逆転写とPCRを同じ反応混合物内で連続的に実施する方式。
- two-step RT-PCR
- 逆転写を別工程で行い、得られたcDNAを別のPCRで増幅する方式。
- 定量的RT-PCR（RT-qPCR）
- リアルタイム蛍光検出によりRNA量を定量するRT-PCR。
- 蛍光系統
- 増幅産物を蛍光で検出する手法の総称。代表例にはSYBR GreenやTaqManがある。
- SYBR Green法
- 二重鎖DNAに結合して蛍光を発する蛍光染料を用いる検出法。
- TaqManプローブ
- 特異的な蛍光プローブを用いて増幅時の蛍光を検出する検出法。
- エンドポイントRT-PCR
- 反応最終産物をゲル電気泳動等で定性に検出する従来型のRT-PCR。
- アンプリコン
- PCRで増幅される特定のDNA断片のこと。
- 増幅効率
- PCR反応がどれだけ効率的に倍増するかを表す指標（理想は100%付近）。
- 閾値サイクル（Ct値）
- 蛍光が閾値を越えたサイクル数。定量に用いられる指標。
- ΔCt
- ターゲット遺伝子のCtと内部参照遺伝子のCt差。
- ΔΔCt法
- 異なるサンプル間の相対発現量を計算するための手法。
- 内在的参照遺伝子
- 発現レベルが安定な基準遺伝子。例: GAPDH、ACTB、18S rRNA。
- ハウスキーピング遺伝子
- 内在的参照遺伝子の別称。
- ノーマライゼーション
- サンプル間の比較を正確にするため、参照遺伝子でデータを補正すること。
- 正の対照
- 陽性のサンプルを用いて反応が機能していることを確認するコントロール。
- 陰性対照
- 反応汚染を検出するためのコントロール。反応が陰性になることを期待する。
- DNase処理
- 試料中のゲノムDNAを除去してRNA purityを高める処理。
- RNase阻害剤
- RNAを分解するRNaseの活性を抑制する成分。
- RNA品質指標
- RNAの分解状態や純度を示す指標。RIN、A260/280など。
- RIN
- RNA Integrity Numberの略。RNAの分解程度を示す指標。
- A260/280
- 核酸の純度を示す比率。理想は約1.8–2.0程度。
- ゲノムDNA汚染
- ゲノムDNAが混入して偽陽性の原因となる問題。
- 標準曲線
- 既知濃度の標準サンプルを用いて定量を補正するための曲線。
- 2^-ΔΔCt法
- 相対発現量を計算する標準的な数式。
- ウイルスRNA検出
- RT-qPCRを用いてウイルスRNAの存在と量を検出・推定する応用。
- 発現解析
- 遺伝子の発現量を比較・解析する目的のRT-PCRの用途。
- RNA抽出
- 細胞組織サンプル等から総RNAを抽出する前処理。
- プライマー設計
- 特異性と効率を左右するためのプライマーを設計する工程・考え方。
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